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在原核表达平台上获得高产、活性可溶蛋白

对于很多研究者来说,把E. coli 作为重组蛋白表达的首选平台有着种种符合逻辑的优点:便宜,周期短,操作更省心。确 实,在大肠杆菌中,人们直接获得了很多可溶的活性蛋白产物,但是更多的情况,却是得到了一些不可溶的包涵体,这些被错误折叠的蛋白没有活性。默克密理博 Novagen的蛋白研究专家团队创造了一系列解决方案,或者促进蛋白在表达过程中进行正确折叠,或者在体外获得正确的包涵体复性条件,最终在原核表达平 台上获得足量的活性蛋白产物。

优化表达条件

A. 增加蛋白溶解性及折叠
由于pET系统的高表达水平,即使有大量的目的蛋白聚集形成包涵体,也会有相当多的可溶性目的蛋白存在。在通常情况下,降低蛋白合成速率,如降低诱导培养 温度及在基本培养基中生长都会使目的蛋白的可溶性增加。在许多应用中需要目的蛋白以可溶及活性形式存在。下列建议将有助于增加目的蛋白的可溶性。需要注意 的是蛋白可溶并不意味着蛋白正确折叠,一些可溶的蛋白并无活性。载体、宿主菌、蛋白序列和培养条件都会降低或升高蛋白可溶/不溶形式的比例。

温度
37℃生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体,而30℃生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白(Schein和Noteborn,1989)。如果你打算利用 一些pET载体中的信号肽序列输出蛋白的话,在25℃或30℃生长和培养可能是最优化的。在某些情况下,低温(15-20℃)延长诱导时间(过夜)可以使 溶解性蛋白的产量达到最大。

裂解缓冲液
裂解缓冲液的性质会大大影响到目的蛋白可溶与不溶形式之间的比例。当采用一般的裂解缓冲液如1×His Bind结合缓冲液(包括500mM NaCl)时,一些包含疏水或膜相关结构域的蛋白可能被归于不溶部分,但并不出现在包涵体中。在裂解缓冲液中加入毫摩尔的非离子型或双性去污剂可以将由于 与细菌脂或膜结合而不溶的蛋白组分转变成可溶组分。BugBuster™蛋白抽提试剂或PopCulture试剂与rLysozyme™溶剂一起使用,是 使蛋白溶解的理想选择。非离子型和双性去污剂能够溶解细胞壁和膜组分,因此无需变性就可以释放出胞内蛋白。BugBuster™和PopCulture™ 中的去污剂可以使一些膜结合蛋白或疏水蛋白溶解。其它一些去污剂也可能用来溶解这些膜蛋白,但有可能其中一些不能溶解。选择合适的去污剂来溶解蛋白仍是一 件需要实验摸索的事。如何在细菌裂解中选用去污剂,见实验2:大鼠肝胰岛素受体的溶解与纯化(Brennan和Lin,1996)。注意,加入去污剂可能 会对下游的纯化操作带来影响。包含高电荷结构域的目的蛋白可能与其它一些细胞元件关联(如可能与DNA结合)。在这种情况下目标蛋白可能与细胞碎片在一 起,理论上可以在裂解缓冲液中加入盐或用Benzonase核酸酶消化核酸来解决这类问题。

细胞周质定位
另一个得到活性可溶蛋白的策略就是采用可以将蛋白运输到细胞周质的载体。在周质中更有利于蛋白折叠及二硫键的形成(Rietsch et. Al.1996; Raina和Missiakas, 1997; Sone et al., 1997)。为了达到此目的,选用带有信号肽的载体,如pET-12,20,22,25,26,27,36,37,38,39,40。然而一些目的蛋白并 不适合被运输到周质中。例如一些与β-gal融合的周质蛋白被证明是有毒的(Snyder和Silhavy, 1995)。另外一些成熟蛋白N端氨基酸的净电荷可能抑制转运过程(Kajava et al., 2000)。
一些pET载体包含信号序列与目的蛋白融合,如pET-39b( )和pET-40b( )所设计的融合序列分别表达在周质中催化形成二硫键的 (DsbA)酶和使二硫键异构化的(DsbC)酶(Missiakas et al.,1994; Zapun et al., 1995)。如果融合蛋白可以被运输到周质中,直接与酶相偶联可以增加蛋白的可溶性及促进二硫键的形成。在与DsbA融合之后,蛋白生成二硫键并正确折叠 产生活性(Collins-Racie et al.,1995)。注意,过表达的DsbC酶是以氧化形式存在,它必须暴露于还原试剂中(0.1-1.0mM DTT)在体外才表现出二硫键异构酶的活性(Joly and Swartz, 1997)。pET-40b( )表达的融合蛋白一般先经His•Bind或Ni-NTA His•Bind纯化。在融合蛋白接触还原剂之前,加入终浓度为1mM的EDTA,或将样品透析以去除残余Ni2 。如使用Ni-NTA His•Bind树脂进行纯化,EDTA和透析都不必进行。

细胞质定位
Trx•Tag™、GST•Tag™和Nus•Tag™融合标签都是高度可溶的多肽,可以增加目的蛋白的溶解性。如果选用的载体在胞质中表达蛋白,采用在 胞质中可以生成二硫键的E.coli宿主菌将有助于折叠(见宿主菌部分)。在载体中都设计了位点专一性蛋白酶识别位点,使融合标签可以被完全去除。血吸虫 谷胱甘肽-S-转移酶(GST)通常在E.coli蛋白表达中被用作N端融合伴侣。尽管并非为此目的而特殊设计,GST•Tag序列也可以增加融合蛋白的 可溶性。pET-41a-c( )和pET-42a-c( )载体编码GST•Tag序列,可以分别被凝血酶、肠胰酶和Xa因子切割。注意,这些载体都是 卡那抗性因此不适用trxB突变宿主菌。
原来在E.coli中以不溶形式存在的蛋白当与N-端硫氧还蛋白(Trx•Tag)序列融合后,往往可增加溶解性(LaVallie et al.,1993; Novy et al.,1995)。pET-32a-c( )中的Trx•Tag不仅可以增强一些蛋白的可溶性,也可以在trxB突变菌的胞质中催化二硫键的形成 (Stewart, 1998)。pET-32a-c( )与trxB/gor突变菌Origami™,Origami B和Rosetta-gami™相匹配,而这些菌株都可以在胞质中促进二硫键的形成,因此这样的组合可以获得最大产量的可溶、有活性及正确折叠的目的蛋 白。pET-43.1a-c( )和pET-44a-c( )载体整合了一个促溶解多肽Nus•Tag序列,这是经E.coli蛋白表达系统研究开发、在 过表达时具有最高可溶性的多肽(Davis et al., 1999; Harrison, 2000)。测试中4种不同的NusA 融合蛋白可溶性都超过了85%(Harrison,2000)。pET-43.1a-c( )和pET-44a-c( )载体也与trxB/gor突变菌 Origami™,Origami B 和Rosetta-gami™相匹配,而这些菌株都可以在胞质中促进二硫键的形成。

宿主菌
许多蛋白需要形成二硫键才得以正确折叠并产生活性;然而,E.coli的胞质并不是一个促进二硫键形成的有利环境。采用Origami™、Origami B、Rosetta-gami™、AD494 或BL21trxB 宿主菌可以促进这些菌株胞质中二硫键的形成,进而影响目的蛋白的可溶性及活性。AD494和BL21trxB菌株是硫氧还蛋白还原酶(trxB)突变体。 Origami™,Origami B, Rosetta-gami™菌株不仅是硫氧还蛋白还原酶(trxB)突变体,还是谷胱甘肽还原酶(gor)突变体,这进一步增强了二硫键的形成。如果目的 蛋白中既含有二硫键,其目的基因还同时包含稀有密码子,Rosetta-gami™菌株是最佳的选择。如果目的蛋白中含有一个或更多的关键二硫 键,pET-32a-c( )载体与trxB或trxB/gor宿主菌的组合被证明是最佳的选择,因为在胞质中二硫键的形成取决于硫氧还蛋白的存在 (Stewart,1998)。Tuner™及其衍生菌株(Origami™B和Rosetta™)是BL21菌株的lacY1缺失突变体,可以在培养过 程中调节所有细胞蛋白表达的水平。通过调节IPTG的浓度,表达可以从很低水平调节至最高水平,直至pET载体完全诱导的水平。低水平表达可能增加一些困 难目的蛋白的可溶性和活性。

体外复性

要在体外简单的缓冲液条件下模拟细胞中各种酶和辅因子帮助蛋白形成正确结构的尝试成功率非常低,寻找正确的条件可谓“大海捞针”,而且不同的蛋白要 求不同的条件,因此复性一直使研究者觉得难以下手。然而,如果能在便宜的原核系统平台上获得活性蛋白产物,特别是生产级的活性产物,依然具有足够的吸引 力,研究者们不懈探索,寻求针对不同蛋白的最佳复性条件。默克密理博Novagen的蛋白复性专家经过大量枯燥的探索性工作,总结和研发出iFold系列 蛋白重折叠系统,使蛋白复性成功唾手可得。iFOLD™蛋白重折叠系统以96孔板式提供, 基于蛋白折叠数据库(http://refold.med.monash.edu.au)制成不同缓冲液体系,现在已经上市系统1、2、3,研究者可以根 据蛋白特性选择合适的试剂盒,配套96孔板式D-tube可以达到事半功倍的效果。

查看Novagen原版目录或本网站相关页面,了解更多详细信息。

默克密理博为您准备的在原核平台上获得高产可溶活性蛋白的完整解决方案:

  • 带有增加可溶性融合标签的表达载体

pET NusA Vectors
pET Trx Vectors
pET GST Vectors
pET Dsb Vectors
pET Signal Sequence Vectors
共表达载体
Duet Vectors
Gateway Nova DEST Vectors

  • Origami™增强二硫键折叠宿主菌系列

Origami 2 Host Strains
Origami B Host Strains
Rosetta-gami™ 2 Host Strains

  • 蛋白可溶性快速筛查

RoboPop™ Solubility Screening Kit

  • 体外蛋白复性缓冲液矩阵系统

iFOLDR System 1
iFOLD System 2
iFOLD System 3
FoldACE™ Reagents
Protein Refolding Kit
iFOLD System Refolding Additives for Scale-up
NDSB Refolding Agents