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1周完成昆虫细胞表达效果评估

哪个宿主细胞表达系统是特定目的蛋白的最佳表达系统?这是对目的蛋白有活性和产量要求的表达课题要解决的基本问题之一,特别是要进行大规模生产蛋白 和高通量(high-throughput,即HT)表达时,早期高效摸索步骤非常关键。平行尝试目的蛋白在大肠杆菌、酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞中的 表达产量、翻译后加工及活性,最终做出取舍。由于昆虫细胞具有许多远胜于其它宿主的优势,成为需要有天然生物学活性蛋白表达的首选平台。但限于传统的杆状 病毒操作较为麻烦,准备实验就需要1个月的时间,很多研究者把昆虫系统排除在考虑范围之外,非常可惜。如果能像其它系统一样,只需要将已知或未知的开放阅 读框(ORF)直接插入质粒并转入昆虫细胞中进行表达评估呢?默克密理博Novagen的重组表达专业团队终于解决了这个问题,使昆虫细胞表达系统具有了 极大的方便性。这就是可以在Sf9(Spodoptera)中进行瞬时表达的InsectDirect™系列昆虫细胞表达载体,借助这个新型工具,1个星 期完成单个或大规模基因的昆虫细胞平台表达评估将变得容易。

昆虫表达系统的特点和优点:

  • 提供快速表达筛选模式和长效高产表达模式
  • 外源基因可达12kb,适合用于大蛋白及疫苗生产或进行蛋白互作研究
  • 完善的翻译后加工,适合蛋白功能研究及活性蛋白生产
  • 强启动子支持目的蛋白产量达总蛋白的50%
  • 产量高、翻译后加工正确,是蛋白结晶和结构研究的理想平台
  • 生物安全性极佳,是人用药物生产的最佳系统

与传统的昆虫细胞表达必须进行繁琐的重组杆状病毒制备*需要进行多步骤的同源重组、病毒滴定、纯化扩增不同,InsectDirect™昆虫细胞快 速表达系统采用了瞬时表达质粒pIEx™能直接进行基因克隆、细胞转染,完成mg级的蛋白表达筛选,并方便扩大规模,而操作时间仅需1周。pIEx™上使 用的是AcNPV病毒立早期启动子ie1加特别工程化设计的hr5增强子设计,这样在转染宿主细胞后,不经病毒形成即可开始基因的转录与翻译,生产目的蛋 白。如果采用Novagen的LIC(不依赖连接反应的快速克隆)方法,正确的重组质粒在1天内即可获得,特别适合高通量表达克隆的制备。配套的昆虫细胞 专用的GeneJuice是非脂质体配方的新型转染试剂,将重组的pIEx质粒转入Sf9或Sf21细胞,不需要更换培养基,在有或者没有血清的情况下都 可以获得高效低毒的转染效果,使用非常方便。经过两天的表达、富集蛋白,下游采用温和高效的抽提方法,也非常重要。为了减少离心、超声等操作对活性大蛋白 的损坏,建议采用PopCulture或CytoBuster等昆虫细胞专用的试剂直接进行细胞裂解和蛋白抽提,在这个过程中同时加入Benzonase 核酸酶能快速降解染色体DNA,减少样品粘度,提高蛋白操作效率和纯化得率。以上抽提方法与高通量自动纯化平台MultiPROBEII HT EX Liquid Handling Station(PerkinElmer)兼容,进行Ni-NTA及其它亲和纯化。通过这一优化的实验方案,进行高通量突变体、同源异构体表达筛选不再困 难。

* Novagen的BacMagic杆状病毒制备体系可以直接将环化的BacMagic病毒骨架直接与带有外源基因的穿梭质粒在昆虫细胞中进行100%高效 重组,省去了噬斑纯化的繁琐操作,大大提高了病毒制备效率,使杆状病毒高效表达模式的建立消耗时间缩短至10天。详情请参考本网站相关页面。

1周快速评估,你也可以

查看本网站相关页面,了解更多详细信息:

  • pIEx及pIEx LIC基因克隆表达质粒试剂盒
  • 昆虫细胞专用GeneJuice转染试剂(目录号71187)
  • 昆虫细胞PopCulture抽提试剂(目录号71259)
  • His·Tag、GST·Tag、Strep·Tag等纯化、检测产品